Pewarnaan Gram (Mikrobiologi)
BAB
I
PENDAHULUAN
1.1 Latar Belakang
Bakteri
adalah makhluk hidup yang sangat kecil dan hanya dapat dilihat dengan
mikroskop. Ini berarti pula bahwa bakteri cukup tipis sehingga tembus cahaya.
Akibatnya pada mikroskop tidak tampak jelas dan sukar untuk melihat
bagian-bagiannya. Sehingga untuk mengatasi hal tersebut maka perlu dilakukan
pengecatan atau pewarnaan pada tubuh bakteri tersebut.
Pewarnaan
gram pertma kali dikemukakan oleh Christian Gram pada tahun 1884. Pada dasarnya
pewanaan gram adalah pewarnaan majemuk, karena menggunakan lebih dari satu
macam zat warna dan pewarnaan diferensial, karena pewarnaan ini mampu
mendeferensiasi atau membedakan bakteri, sehingga bakteri dapat digolongkan
menjadi dua kelompok, yaitu gram negatif dan gram positif.
Penggunaan prinsip pewarnaan gram ini akan membantu
dan mempermudah untuk melakukan identifikasi bakteri dan berdasarkan hal itu
lah kita melakukan praktikum pewarnaan gram ini agar praktikan dapat mengenal
dan mempelajari prosedur pewarnaan gram serta memahami prosedur pewarnaan
warna.
1.2 Rumusan masalah
Bagaimana prosedur pewarnaan gram pada praktikum kali ini?
1.3 Tujuan Praktikum
Tujuan praktikum kali ini adalah untuk mengenal dan mempelajari prosedur
pewarnaan gram serta memahami pentingnya setiap langkah dalam prosedur
pewarnaanya.
BAB
II
TINJAUAN
PUSTAKA
2.1 PengertianPewarnaan Gram
Pewarnaan garam adalah suatu metode empiris untuk membedakan spesies bakteri
menjadi dua kelompok besar, yaitu gram positif dan gram negatif, berdasarkan
sifat kimia dan fisik dinding sel mereka. Metode ini diberi nama berdasarkan
penemunya, ilmuan Denmark Hans Cristian Gram (1853-1938) yang mengembangkan
tehnik ini pada tahun 1884 untuk membedakan antara pneumokokus dan bakteri
klebsiella pneumoniae. Pewarnaan
Gram adalah pewarnaan diferensial yang sangat berguna dan paling banyak
digunakan dalam laboratorium mikrobiologi, karena merupakan tahapan penting
dalam langkah awal identifikasi. Pewarnaan ini didasarkan pada tebal atau
tipisnya lapisan peptidoglikan di dinding sel dan banyak sedikitnya lapisan
lemak pada membran sel bakteri. Jenis bakteri berdasarkan pewarnaan gram dibagi
menjadi dua yaitu gram positif dan gram negatif. Bakteri gram positif memiliki
dinding sel yang tebal dan membran sel selapis. Sedangkan baktri gram negatif
mempunyai dinding sel tipis yang berada di antara dua lapis membran sel (Iud,2008).
2.2Jenis Pewarnaan Pada Bakteri
Pewarnaan sederhana merupakan teknik
pewarnaan yang paling banyak digunakan. Disebut sederhana karena hanya
menggunakan satu jenis zat warna untuk mewarnai organisme tersebut. Kebanyakan
bakteri mudah bereaksi dengan pewarnaan-pewarnaan sederhana karena
sitoplasamanya bersifat basofilik (suka dengan basa). Zat-zat warna yang
digunakan untuk pewarnaan sederhana umumnya bersifat alkolin. Dengan pewarnaan
sederhana dapat mengetahui bentuk dan rangkaian sel-sel bakteri. Pewarna basa
yang biasa digunakan untuk pewarnaan sederhana ialah metilen biru, kristal
violet, dan karbol fuehsin yang mana pewarnaan sederhana ini dibagi lagi
menjadi dua jenis pewarnaan (Entjaang,2003).
a. Pewarnaan asam
Merupakan
pewarnaan yang menggunakan satu macam zat warna dengan tujuan hanya untuk
melihat bentuk sel. Adapun zat warna yang dipakai dalam pewarnaan positif
adalah metilen biru dan air furksin.
b. PewarnaanBasa
Pewarnaan basa atau negatif merupakan metode pewarnaan untuk mewarnai bakteri tetapi mewarnai latar belakangnya menjadi hitam gelap. Pada pewarnaan ini mikroorganisme kelihatan transparan (tembus pandang). Teknik ini berguna untuk menentukan morfologi dan ukuran sel. Metode ini menggunakan cat nigrosin atau tinta cina (Entjang,2003).
Pewarnaan basa atau negatif merupakan metode pewarnaan untuk mewarnai bakteri tetapi mewarnai latar belakangnya menjadi hitam gelap. Pada pewarnaan ini mikroorganisme kelihatan transparan (tembus pandang). Teknik ini berguna untuk menentukan morfologi dan ukuran sel. Metode ini menggunakan cat nigrosin atau tinta cina (Entjang,2003).
Bakteri Gram-negatif adalah bakteri yang tidak
mempertahankan zat warna metil ungu pada metode pewarnaan Gram. Bakteri gram
positif akan mempertahankan zat warna metil ungu gelap setelah dicuci dengan
alkohol, sementara bakteri gram negatif tidak. Pada uji pewarnaan Gram, suatu pewarna
penimbal (counterstain) ditambahkan setelah metil ungu, yang membuat semua
bakteri gram negatif menjadi berwarna merah atau merah muda. Pengujian ini
berguna untuk mengklasifikasikan kedua tipe bakteri ini berdasarkan perbedaan
struktur dinding sel mereka (Dwidjoseputro, 1987).
2.3
Dasar Pewarnaan
Bakteri hidup sukar
untuk dilihat dengan mikroskop cahaya biasa karena bakteri itu tampak tidak
berwarna jika diamati secara sendiri-sendiri, walaupun biakannya secara
keseluruhan mungkin berwarna. Bakteri lebih sering diamati dalam olesan
terwarnai daripada dalam keadaan hidup. Yang dimaksud bakteri terwarnai adalah
organisme yang telah diwarnai dengan zat pewarna kimia agar mudah dilihat dan
dipelajari. Pada umumnya, olesan bakteri terwarnai mengungkapkan ukuran,
bentuk, susunan dan adanya struktur internal seperti spora dan butiran (Schegel,
1994).
Pada umumnya jenis – jenis pengecatan
dibagi atas 4 macam yaitu (Awetz, 2008):
a. Pewarnaan negatif yaitu dengan pewarnaan latar belakang sel dengan zat warna asam, sehingga sel–sel tersebut secar kontras tidak berwarna. Yang biasanya dipakai adalah zat warna hitam nigrosin. Metode ini digunakan untuk sel–sel dan struktur-struktur yang sukar diwarnai secara langsung.
b. Pengecatan sederhana, yaitu pewarnaan yang hanya satu macam cat saja. Biasanya bakteri maupuin sekitarnya akan mempunyai warna yang sama, tetapi dengan intensitas yang berbeda. Pewarna sederhana yaitu tipe pewarna yang paling sederhana, caranya hanya dengan menambahkan pada olesan yang telah difiksasi salah satu diantaranya zat warna berikut : lembayung gentian, lembayung safranin, biru metilen, furchin bara dan zat warna anilin barayanglainnya
c. Pengecatan khusus digunakan untuk melihat alat tambahan pada bakteri.
d. Pengecatan diferensial menggunakan lebih dari satu macam zat warna.
a. Pewarnaan negatif yaitu dengan pewarnaan latar belakang sel dengan zat warna asam, sehingga sel–sel tersebut secar kontras tidak berwarna. Yang biasanya dipakai adalah zat warna hitam nigrosin. Metode ini digunakan untuk sel–sel dan struktur-struktur yang sukar diwarnai secara langsung.
b. Pengecatan sederhana, yaitu pewarnaan yang hanya satu macam cat saja. Biasanya bakteri maupuin sekitarnya akan mempunyai warna yang sama, tetapi dengan intensitas yang berbeda. Pewarna sederhana yaitu tipe pewarna yang paling sederhana, caranya hanya dengan menambahkan pada olesan yang telah difiksasi salah satu diantaranya zat warna berikut : lembayung gentian, lembayung safranin, biru metilen, furchin bara dan zat warna anilin barayanglainnya
c. Pengecatan khusus digunakan untuk melihat alat tambahan pada bakteri.
d. Pengecatan diferensial menggunakan lebih dari satu macam zat warna.
BAB
III
METODOLOGI
3.1 Waktu dan Tempat
Praktikum
dasar-dasar pewarnaan gram telah dilaksakan pada hari Kamis pada tanggal 1
April 2014, bertempat di Laboratorium Dasar Universitas Muhammadiyah Pontianak.
3.2 Alat dan Bahan
3.2.1. Alat
Nama alat
|
Jumlah
|
Akuades steril
|
~
|
Alcohol 70%
|
~
|
Bunsen
|
1
|
Botol semprot
|
1
|
Gelas objek
|
Secukupnya
|
Jarum ose
|
2
|
Mikroskop
|
1
|
Penjepit
|
1
|
3.2.2 Bahan
Nama
bahan
|
Jumlah
|
Biakan
bakteri yang berumur 24 jam
|
|
Satu
set pewarna gram;gram A,gram B,gram C dan gram D
|
|
3.3 Cara kerja
|
||||
![]() |
|
||||||||
|
||||||||
![]() |
||||||||
|
||||||||
|
||||||||
|
|

![]() |
||||||||||||||
![]() |
||||||||||||||
|
||||||||||||||
![]() |
||||||||||||||
![]() |
||||||||||||||
|
||||||||||||||
|
||||||||||||||
![]() |
||||||||||||||
|
||||||||||||||
![]() |
||||||||||||||
![]() |
||||||||||||||
BAB IV
HASIL DAN PEMBAHASAN
4.1.
Hasil
Nama Sampel
|
Pengenceran
|
Gambar
|
Nama Bakteri
|
Jenis Gram
|
Kolam
|
10-4
|
![]() |
Diplobasil
|
Gram Negatif
|
|
10-5
|
|
|
|
Usus
|
10-4
|
![]() |
Monokokus
|
Gram Positif
|
|
10-5
|
|
|
|
4.2 Pembahasan
4.2.1
Pengertian
bakteri
Bakteri
adalah mikroorganisme yang sangat sederhana yang tidak bernukleus dan sifatnya
berbeda dengan organisme yang mempunyai inti sel. selain itu bakteri merupakan
organisme yang sangat kecil (yang berukuran mikroscopis) akibatnya pada
mikroskop tidak tampak jelas dan sukar untuk melihat morfologinya maka dari itu
dilakukan pewarnaan bakteri yang biasa disebut pengenceran baketri. pada
umumnya larutan-larutan zat warna yang digunakan adalah larutan encer yang
lebih dari satu persen.
4.2.2
Pengertian
perwarnaan gram
Pewarnaan
Gram adalah pewarnaan diferensial yang sangat berguna dan paling banyak
digunakan dalam laboratorium mikrobiologi, karena merupakan tahapan penting
dalam langkah awal identifikasi. Pewarnaan ini didasarkan pada tebal atau
tipisnya lapisan peptidoglikan di dinding sel dan banyak sedikitnya lapisan
lemak pada membran sel bakteri.
Pewarnaan gram atau metode
gram adalah suatu metode untuk membedakan spesies bakteri menjadi dua kelompok
besar. gram positif dan gram negatif, cat gram yang digunakan terdiri dari 4
macam yang masing-masing mempunyai komposisi dan fungsi yang berbeda. gram
merupakan cat yang terdiri dari campuran kristal violel, etil alkohol,
cimemonilium oksalai dan aquadest. bkan merupakan bahan kimia berbahaya dan
biasa digunakan pewarnaan mikroskopi, baik bakteri gram positif maupun gram
negatif memberikan warna yang sama (ungu) pada pewarnaan dengan gram A.
4.2.3 Langkah-langkah pewarnaan
Pengecatan diferensial mengunakan
dua warna yang kontras untuk membedakan antara jenis organisme yang berbeda.ada
empat bahan yang biasanya di gunakan dalam pewarnaaa gram adalah sebagai
berkut:
Pewarnaan Gram merupakan salah satu teknik pewarnaan yang digunakan untuk mengidentifikasi bakteri (mikroorganisme). Zat warna yang digunakan pada pengecatan Gram meliputi crystal violet, yodium , alkohol dan safranin. Fungsi dari masing-masing zat warna tersebut adalah :
Pewarnaan Gram merupakan salah satu teknik pewarnaan yang digunakan untuk mengidentifikasi bakteri (mikroorganisme). Zat warna yang digunakan pada pengecatan Gram meliputi crystal violet, yodium , alkohol dan safranin. Fungsi dari masing-masing zat warna tersebut adalah :
1.Crystal Violet
Berwarna
ungu. Merupakan pewarna primer (utama) yang akan memberi warna mikroorganisme
target. Crystal Violet bersifat
basa sehingga mampu berikatan dengan sel mikroorganisme yang bersifat asam, dengan
begitu sel mikroorganisme yang transparan akan terlihat berwarna (Ungu).
2. Yodium
Merupakan
pewarna Mordan , yaitu pewarna yang berfungsi memfiksasi pewarna primer yang
diserap mikroorganisme target. Pemberian yodium pada pengecatan gram dimaksudkan
untuk memperkuat pengikatan warna oleh bakteri.
3. Alkohol
Solven
organik yang berfungsi untuk membilas atau melunturkan kelebihan zat warna pada
sel bakteri (mikroorganisme). Pemberian alkohol pada pengecatan ini dapat
mengakibatkan terjadinya dua kemungkinan :
Mikroorganisme
(bakteri) akan tetap berwarna ungu
Bakteri
menjadi tidak berwarna
4. Safranin
Safranin
merupakan pewarna tandingan atau pewarna sekunder. Zat ini berfungsi untuk
mewarnai kembali sel-sel yang telah kehilangan pewarna utama setelah perlakuan
dengan alkohol. Dengan kata lain , memberikan warna pada mikroorganisme non
target.
Cara pengamatan bakteri pada pewarnaan
gram ini adalah mengambil bakteri yang didapat dari air usus ikan patin.
Pewarnaan ini dilakukan dengan mengambil sedikit larutan sample dengan bantuan
jarumose yang sebelumya telah di panaskan dengan api bunnsen dan meletakkannya
diatas kaca preparat.Langkah pertamayaitu, 1 tetes
kristal violet diteteskan di atas gelas benda tersebut kemudian didiamkan
selama 30 detik. Setelah itu, gelas benda dibilas dengan aquades hingga
warnanya hilang. Kristal violet merupakan reagen yang berwarna ungu. Kristal
violet ini merupakan pewarna primer (utama) yang akan memberi warna pada
mikroorganisme target. Kristal violet bersifat basa sehingga mampu berikatan
dengan sel mikroorganisme yang bersifat asam. Dengan perlakuan seperti itu, sel
mikroorganisme yang transparan akan terlihat berwarna (ungu). Pemberian kristal
violet pada bakteri gram positif akan meninggalkan warna ungu muda.Setelah itu di keringkan dengan
mmenggunakan hair dryer sampai benar-benar kering .
Perlakuan dengan gram negatif yaitu campuran iodiumm,
kalium iodium dan aquades. Gram B merupakan larutan mordan yang berfungsi untuk
mengangkat aktifitas pengikat zat warna oleh bakteri sehingga pengikt zat warna
oleh bakteri lebih kuat. memperjelas
warna dari zat tersebut mempersulit pewarnaan zat warna, pada pewarnaan
terbentuknya persenyawaan komplekskistal violet yodium. tanpa penambahan
larutan . zat warna kristal violet akan larut saat penambahan larutan pemulai
gram merupakan cat yang terdiri dari campuran asetan dan etil alkohol. gram c merupakan larutan
pemulai. larutan pemulai berfungsi untuk melarutkan lipid pada membran bakteri
gram negatif yang akan menyebabkan pori-pori sel membesar sehingga meningkatkan
daya larut persenyawaan kristal violet yodium. gram D merupakan cat yang
terdiri dari campuran safrafin-etil alohol dan aquadest. safranin pada gram D tidak
akan menyebabkan perubahan warna pada bakteri positif karena persenyawaan kompleks kristal violet. yodium
tetap terikat pada dinding-dinding sel. pada bakteri gram negatif, penambahan
safranin akan menyebabkan warna bakteri berubah menjadi merah , karena ungu
yang dihasilkan oleh kristal violet yodium telah luntur dengan tipisnya membran
sel sehingga safrafin dapat terikat. oleh karena itu gram D atau zat kedua
berfungsi sebagai membedakan terhadap zat kedua berfungsi sebagi membeda
terhadap zat warna kristal violet.
Langkah selanjutnya, 1 tetes kristal violet diteteskan di atas gelas benda
tersebut kemudian didiamkan selama 30 detik. Setelah itu, gelas benda dibilas
dengan aquades hingga warnanya hilang. Kristal violet merupakan reagen yang
berwarna ungu. Kristal violet ini merupakan pewarna primer (utama) yang akan
memberi warna pada mikroorganisme target. Kristal violet bersifat basa sehingga
mampu berikatan dengan sel mikroorganisme yang bersifat asam. Dengan perlakuan
seperti itu, sel mikroorganisme yang transparan akan terlihat berwarna (ungu).
Pemberian kristal violet pada bakteri gram positif akan meninggalkan warna ungu
muda. Perbedaan respon terhadap
mekanisme pewarnaan gram pada bakteri adalah didasarkan pada struktur dan
komposisi dinding sel bakteri. Bakteri gram positif mengandung protein dan gram
negatif mengandung lemak dalam persentasi lebih tinggi dan dinding selnya
tipis. Kristal violet yang diteteskan didiamkan selama 30 detik bertujuan agar
cat atau pewarna ini dapat melekat sempurna pada dinding sel bakteri.
Langkah percobaan yang dilakukan oleh praktikan dimulai dengan 1 tetes
sampel yang berupa bakteri sampel A dan bakteri sampel B diteteskan di atas
gelas benda yang berbeda. Kedua gelas benda berisi sampel tersebut dipanaskan
(fiksasi) di atas bunsen burner. Hal ini bertujuan untuk menguapkan air
sehingga hanya akan didapat bakteri saja. Proses fiksasi juga bertujuan supaya
bakteri benar-benar melekat pada gelas benda sehingga olesan bakteri berupa
tetesan sampel tidak akan terhapus apabila dilakukan pencucian. Yang perlu
diperhatikan dalam proses fiksasi adalah bidang yang mengandung bakteri dijaga
agar tidak terkena nyala api.
Langkah selanjutnya, 1 tetes iodine diteteskan di atas gelas benda tersebut
kemudian didiamkan selama 1 menit. Setelah itu, gelas benda dibilas dengan
aquades hingga warnanya hilang. Iodine merupakan pewarna Mordan, yaitu pewarna
yang berfungsi memfiksasi pewarna primer yang diserap mikroorganisme target
atau mengintensifkan warna utama. Pemberian iodine pada pengecatan Gram
dimaksudkan untuk memperkuat pengikatan warna oleh bakteri. Kompleks zat iodin
terperangkap antara dinding sel dan membran sitoplasma organisme gram positif,
sedangkan penyingkiran zat lipida dari dinding sel organisme gram negatif
dengan pencucian alkohol memungkinkan hilang dari sel. Iodine yang diteteskan
didiamkan selama 1 menit bertujuan agar pengikatan warna oleh bakteri menjadi
semakin lebih kuat.
Selanjutnya, 1 tetes alkohol 96% diteteskan di atas gelas benda tersebut
kemudian didiamkan selama 30 detik. Setelah itu, gelas benda dibilas dengan
aquades hingga warnanya hilang. Etanol 95% merupakan solven organik yang
berfungsi untuk membilas (mencuci) atau melunturkan kelebihan zat warna pada
sel bakteri (mikroorganisme). Tercuci tidaknya warna dasar tergantung pada
komposisi dinding sel, bila komponen dinding sel kuat mengikat warna, maka
warna tidak akan tercuci sedangkan bila komponen dinding sel tidak kuat menelan
warna dasar, maka warna akan tercuci. Pemberian alkohol pada pengecatan ini
dapat mengakibatkan terjadinya dua kemungkinan yaitu mikroorganisme (bakteri)
akan tetap berwarna ungu atau bakteri menjadi tidak berwarna. Pemberian alkohol
96% juga menyebabkan terekstraksi lipid sehingga memperbesar permeabilitas
dinding sel.
Reaksi yang terjadi ketika penambahan alkohol 96%gram + : lipid
<< + alkohol 96% pori dinding sel yang terbentuk kecil, protein
dinding sel terdehidrasi, pori tertutup(kompleks kristal violet-iodine tidak
tercuci)gram - : lipid >> + alkohol 96% pori dinding
sel yang terbentuk besar, protein dinding sel terdehidrasi, pori tidak tertutup
(kompleks kristal violet-iodine tercuci)
4.2.4
Hasil Pengamatan
Pengamatan
yang dilakukan dengan menggunakan mikroskop tampak mikoorganisme dari sampel air
kolam dengan pengenceran 10-4 berbentuk
dipobasil dengan jenis gram negatif. Dimana
bakteri gram negatif adalah bakteri, yang kehilangan kompleks ungu kristal pada
waktu pembilasan dengan alkohol, namun kemdian terwarnai dengan pewara
tandingan, yaitu safranin, sehingga sel-sel tampak berwarna merah muda pada
akhir pewarnaan.
Pengamaan kedua yaitu pada sampel usus
ikan patin dengan pengenceran 10-4 didapat bakteri monococcus dengan
jenis gram positif. Bakteri gram positif adalah bater yang dapat menahan kompleks
pewarna primer ungu kristal iodium sampai akhir prosedur dan sel bakteri
berwarna biru gelap atau ungu.
BAB V
PENUTUP
5.1
Kesimpulan
Bakteri dapat dibedakan melalui
teknik pewarnaan gram. Pewarnaan Gram merupakan salah satu teknik pewarnaan
yang digunakan untuk mengidentifikasi bakteri (mikroorganisme). Zat warna yang
digunakan pada pengecatan Gram meliputi crystal violet, yodium , alkohol dan
safraninTeknik
pewarnaan tersebut dapat menghasilkan warna merah dan ungu.
Bakteri gram negatif ditandai
dengan pewarnaan merah, sedangkan yang positif berwarna ungu. Bakteri yang didapat berdasarkan hasil praktikum,
yaitu diplobasil dengan jenis gram negatif dan monococcus dengan jenis gram
positif.
5.2 Saran
Diharapkan
dalam praktikum selanjutnya alat dan bahan yang dibutuhkan dalam praktikum
mikrobiologi, lebih di tingkatkan ketersediaannya.
DAFTAR
PUSTAKA
Awetz, Melnick, Adelberg. 2008. Mikrobiologi
Kedokteran Edisi
23.
Jakarta: Penerbit Buku Kedokteran EGC.
Dwidjoseputro,
D., 1989. Dasar-Dasar Mikrobiologi.
Djambatan:Malang
Entjang I, 2003, Mikrobiologi dan Parasitologi Untuk Akademi Keperawatan. Jakarta: PT. Citra Aditya Bakti.
Entjang I, 2003, Mikrobiologi dan Parasitologi Untuk Akademi Keperawatan. Jakarta: PT. Citra Aditya Bakti.
Iud, W. 2008. Teknik dan Metode Dasar
Dalam Mikrobiologi. Malang: UMM Pres.
Schlegel,
Hans. 1994. Mikrobiologi Umum Edisi
Keenam. Yogyakarta: Gajah Mada University Press.
1 komentar