Pewarnaan Gram (Mikrobiologi)

by - 07.42



BAB I
PENDAHULUAN
1.1  Latar Belakang
Bakteri adalah makhluk hidup yang sangat kecil dan hanya dapat dilihat dengan mikroskop. Ini berarti pula bahwa bakteri cukup tipis sehingga tembus cahaya. Akibatnya pada mikroskop tidak tampak jelas dan sukar untuk melihat bagian-bagiannya. Sehingga untuk mengatasi hal tersebut maka perlu dilakukan pengecatan  atau pewarnaan pada tubuh bakteri tersebut.
Pewarnaan gram pertma kali dikemukakan oleh Christian Gram pada tahun 1884. Pada dasarnya pewanaan gram adalah pewarnaan majemuk, karena menggunakan lebih dari satu macam zat warna dan pewarnaan diferensial, karena pewarnaan ini mampu mendeferensiasi atau membedakan bakteri, sehingga bakteri dapat digolongkan menjadi dua kelompok, yaitu gram negatif dan gram positif.
Penggunaan prinsip pewarnaan gram ini akan membantu dan mempermudah untuk melakukan identifikasi bakteri dan berdasarkan hal itu lah kita melakukan praktikum pewarnaan gram ini agar praktikan dapat mengenal dan mempelajari prosedur pewarnaan gram serta memahami prosedur pewarnaan warna.
1.2  Rumusan masalah
Bagaimana prosedur pewarnaan gram pada praktikum kali ini?
1.3  Tujuan Praktikum
Tujuan praktikum kali ini adalah untuk mengenal dan mempelajari prosedur pewarnaan gram serta memahami pentingnya setiap langkah dalam prosedur pewarnaanya.






BAB II
TINJAUAN PUSTAKA

2.1 PengertianPewarnaan Gram
Pewarnaan garam adalah suatu metode empiris untuk membedakan spesies bakteri menjadi dua kelompok besar, yaitu gram positif dan gram negatif, berdasarkan sifat kimia dan fisik dinding sel mereka. Metode ini diberi nama berdasarkan penemunya, ilmuan Denmark Hans Cristian Gram (1853-1938) yang mengembangkan tehnik ini pada tahun 1884 untuk membedakan antara pneumokokus dan bakteri klebsiella pneumoniae.         Pewarnaan Gram adalah pewarnaan diferensial yang sangat berguna dan paling banyak digunakan dalam laboratorium mikrobiologi, karena merupakan tahapan penting dalam langkah awal identifikasi. Pewarnaan ini didasarkan pada tebal atau tipisnya lapisan peptidoglikan di dinding sel dan banyak sedikitnya lapisan lemak pada membran sel bakteri. Jenis bakteri berdasarkan pewarnaan gram dibagi menjadi dua yaitu gram positif dan gram negatif. Bakteri gram positif memiliki dinding sel yang tebal dan membran sel selapis. Sedangkan baktri gram negatif mempunyai dinding sel tipis yang berada di antara dua lapis membran sel (Iud,2008).
2.2Jenis Pewarnaan Pada Bakteri
Pewarnaan sederhana merupakan teknik pewarnaan yang paling banyak digunakan. Disebut sederhana karena hanya menggunakan satu jenis zat warna untuk mewarnai organisme tersebut. Kebanyakan bakteri mudah bereaksi dengan pewarnaan-pewarnaan sederhana karena sitoplasamanya bersifat basofilik (suka dengan basa). Zat-zat warna yang digunakan untuk pewarnaan sederhana umumnya bersifat alkolin. Dengan pewarnaan sederhana dapat mengetahui bentuk dan rangkaian sel-sel bakteri. Pewarna basa yang biasa digunakan untuk pewarnaan sederhana ialah metilen biru, kristal violet, dan karbol fuehsin yang mana pewarnaan sederhana ini dibagi lagi menjadi dua jenis pewarnaan (Entjaang,2003).
a.   Pewarnaan asam
Merupakan pewarnaan yang menggunakan satu macam zat warna dengan tujuan hanya untuk melihat bentuk sel. Adapun zat warna yang dipakai dalam pewarnaan positif adalah metilen biru dan air furksin.
b.   PewarnaanBasa
Pewarnaan basa atau negatif merupakan metode pewarnaan untuk mewarnai bakteri tetapi mewarnai latar belakangnya menjadi hitam gelap. Pada pewarnaan ini mikroorganisme kelihatan transparan (tembus pandang). Teknik ini berguna untuk menentukan morfologi dan ukuran sel. Metode ini menggunakan cat nigrosin atau tinta cina (Entjang,2003).
 Bakteri Gram-negatif adalah bakteri yang tidak mempertahankan zat warna metil ungu pada metode pewarnaan Gram. Bakteri gram positif akan mempertahankan zat warna metil ungu gelap setelah dicuci dengan alkohol, sementara bakteri gram negatif tidak. Pada uji pewarnaan Gram, suatu pewarna penimbal (counterstain) ditambahkan setelah metil ungu, yang membuat semua bakteri gram negatif menjadi berwarna merah atau merah muda. Pengujian ini berguna untuk mengklasifikasikan kedua tipe bakteri ini berdasarkan perbedaan struktur dinding sel mereka (Dwidjoseputro, 1987).
2.3 Dasar Pewarnaan
Bakteri hidup sukar untuk dilihat dengan mikroskop cahaya biasa karena bakteri itu tampak tidak berwarna jika diamati secara sendiri-sendiri, walaupun biakannya secara keseluruhan mungkin berwarna. Bakteri lebih sering diamati dalam olesan terwarnai daripada dalam keadaan hidup. Yang dimaksud bakteri terwarnai adalah organisme yang telah diwarnai dengan zat pewarna kimia agar mudah dilihat dan dipelajari. Pada umumnya, olesan bakteri terwarnai mengungkapkan ukuran, bentuk, susunan dan adanya struktur internal seperti spora dan butiran (Schegel, 1994).
Pada umumnya jenis – jenis pengecatan dibagi atas 4 macam yaitu (Awetz, 2008):
a. Pewarnaan negatif yaitu dengan pewarnaan latar belakang sel dengan zat warna asam, sehingga sel–sel tersebut secar kontras tidak berwarna. Yang biasanya dipakai adalah zat warna hitam nigrosin. Metode ini digunakan untuk sel–sel dan struktur-struktur yang sukar diwarnai secara langsung.
b. Pengecatan sederhana, yaitu pewarnaan yang hanya satu macam cat saja. Biasanya bakteri maupuin sekitarnya akan mempunyai warna yang sama, tetapi dengan intensitas yang berbeda. Pewarna sederhana yaitu tipe pewarna yang paling sederhana, caranya hanya dengan menambahkan pada olesan yang telah difiksasi salah satu diantaranya zat warna berikut : lembayung gentian, lembayung safranin, biru metilen, furchin bara dan zat warna anilin barayanglainnya
c.  Pengecatan khusus digunakan untuk melihat alat tambahan pada bakteri.
d.  Pengecatan diferensial menggunakan lebih dari satu macam zat warna.






















BAB III
METODOLOGI
3.1 Waktu dan Tempat
Praktikum dasar-dasar pewarnaan gram telah dilaksakan pada hari Kamis pada tanggal 1 April 2014, bertempat di Laboratorium Dasar Universitas Muhammadiyah Pontianak.
3.2 Alat dan Bahan
3.2.1. Alat
            Nama alat
Jumlah
Akuades steril
~
Alcohol 70%
~
Bunsen
1
Botol semprot
1
Gelas objek
Secukupnya
Jarum ose
2
Mikroskop
1
Penjepit
1

3.2.2 Bahan
Nama bahan
Jumlah
Biakan bakteri yang berumur 24 jam

Satu set pewarna gram;gram A,gram B,gram C dan gram D






3.3 Cara kerja





Di siapkan preparat olesan bakteri
 



 


                                          










Larutan gram A
 


2-3 pada olesan bakteri dan dibiarkan 1 menit
 







Dikeringkan menggunakan kartas isap
 



Cuci dan keringkan
 


Diamati dengan mikroskop
 
 


Cuci dengan akuades
 
                                                        























Larutan gram B (1 menit)
 









Gram C (30 detik)
 


Cuci dan  keringkan keringkan

 






Cuci dan keringkan

 







 











                                






BAB IV
HASIL DAN PEMBAHASAN
4.1. Hasil
Nama Sampel
Pengenceran
Gambar
Nama Bakteri
Jenis Gram
Kolam
10-4
diplobasil.jpeg
Diplobasil
Gram Negatif

10-5




Usus
10-4
monococcus.jpeg
Monokokus
Gram Positif

10-5













4.2 Pembahasan
4.2.1 Pengertian bakteri
Bakteri adalah mikroorganisme yang sangat sederhana yang tidak bernukleus dan sifatnya berbeda dengan organisme yang mempunyai inti sel. selain itu bakteri merupakan organisme yang sangat kecil (yang berukuran mikroscopis) akibatnya pada mikroskop tidak tampak jelas dan sukar untuk melihat morfologinya maka dari itu dilakukan pewarnaan bakteri yang biasa disebut pengenceran baketri. pada umumnya larutan-larutan zat warna yang digunakan adalah larutan encer yang lebih dari satu persen.
4.2.2 Pengertian perwarnaan gram
Pewarnaan Gram adalah pewarnaan diferensial yang sangat berguna dan paling banyak digunakan dalam laboratorium mikrobiologi, karena merupakan tahapan penting dalam langkah awal identifikasi. Pewarnaan ini didasarkan pada tebal atau tipisnya lapisan peptidoglikan di dinding sel dan banyak sedikitnya lapisan lemak pada membran sel bakteri.
Pewarnaan gram atau metode gram adalah suatu metode untuk membedakan spesies bakteri menjadi dua kelompok besar. gram positif dan gram negatif, cat gram yang digunakan terdiri dari 4 macam yang masing-masing mempunyai komposisi dan fungsi yang berbeda. gram merupakan cat yang terdiri dari campuran kristal violel, etil alkohol, cimemonilium oksalai dan aquadest. bkan merupakan bahan kimia berbahaya dan biasa digunakan pewarnaan mikroskopi, baik bakteri gram positif maupun gram negatif memberikan warna yang sama (ungu) pada pewarnaan dengan gram A.
4.2.3 Langkah-langkah pewarnaan
Pengecatan diferensial mengunakan dua warna yang kontras untuk membedakan antara jenis organisme yang berbeda.ada empat bahan yang biasanya di gunakan dalam pewarnaaa gram adalah sebagai berkut:
Pewarnaan  Gram merupakan salah satu teknik pewarnaan yang digunakan untuk mengidentifikasi bakteri (mikroorganisme). Zat warna yang digunakan pada pengecatan Gram meliputi crystal violet, yodium , alkohol dan safranin. Fungsi dari masing-masing zat warna tersebut adalah :
1.Crystal Violet                              
Berwarna ungu. Merupakan pewarna primer (utama) yang akan memberi warna mikroorganisme target. Crystal Violet bersifat basa sehingga mampu berikatan dengan sel mikroorganisme yang bersifat asam, dengan begitu sel mikroorganisme yang transparan akan terlihat berwarna (Ungu).
2. Yodium     
Merupakan pewarna Mordan , yaitu pewarna yang berfungsi memfiksasi pewarna primer yang diserap mikroorganisme target. Pemberian yodium pada pengecatan gram dimaksudkan untuk memperkuat pengikatan warna oleh bakteri.
3. Alkohol
Solven organik yang berfungsi untuk membilas atau melunturkan kelebihan zat warna pada sel bakteri (mikroorganisme). Pemberian alkohol pada pengecatan ini dapat mengakibatkan terjadinya dua kemungkinan :
Mikroorganisme (bakteri) akan tetap berwarna ungu
Bakteri menjadi tidak berwarna
4. Safranin
Safranin merupakan pewarna tandingan atau pewarna sekunder. Zat ini berfungsi untuk mewarnai kembali sel-sel yang telah kehilangan pewarna utama setelah perlakuan dengan alkohol. Dengan kata lain , memberikan warna pada mikroorganisme non target.
Cara pengamatan bakteri pada pewarnaan gram ini adalah mengambil bakteri  yang didapat dari air usus ikan patin. Pewarnaan ini dilakukan dengan mengambil sedikit larutan sample dengan bantuan jarumose yang sebelumya telah di panaskan dengan api bunnsen dan meletakkannya diatas kaca preparat.Langkah pertamayaitu, 1 tetes kristal violet diteteskan di atas gelas benda tersebut kemudian didiamkan selama 30 detik. Setelah itu, gelas benda dibilas dengan aquades hingga warnanya hilang. Kristal violet merupakan reagen yang berwarna ungu. Kristal violet ini merupakan pewarna primer (utama) yang akan memberi warna pada mikroorganisme target. Kristal violet bersifat basa sehingga mampu berikatan dengan sel mikroorganisme yang bersifat asam. Dengan perlakuan seperti itu, sel mikroorganisme yang transparan akan terlihat berwarna (ungu). Pemberian kristal violet pada bakteri gram positif akan meninggalkan warna ungu muda.Setelah itu di keringkan dengan mmenggunakan hair dryer sampai benar-benar kering .
4.2.4 Perlakuan
Perlakuan dengan gram negatif yaitu campuran iodiumm, kalium iodium dan aquades. Gram B merupakan larutan mordan yang berfungsi untuk mengangkat aktifitas pengikat zat warna oleh bakteri sehingga pengikt zat warna oleh bakteri lebih kuat.  memperjelas warna dari zat tersebut mempersulit pewarnaan zat warna, pada pewarnaan terbentuknya persenyawaan komplekskistal violet yodium. tanpa penambahan larutan . zat warna kristal violet akan larut saat penambahan larutan pemulai gram merupakan cat yang terdiri dari campuran asetan  dan etil alkohol. gram c merupakan larutan pemulai. larutan pemulai berfungsi untuk melarutkan lipid pada membran bakteri gram negatif yang akan menyebabkan pori-pori sel membesar sehingga meningkatkan daya larut persenyawaan kristal violet yodium. gram D merupakan cat yang terdiri dari campuran safrafin-etil alohol dan aquadest. safranin pada gram D tidak akan menyebabkan perubahan warna pada bakteri positif karena  persenyawaan kompleks kristal violet. yodium tetap terikat pada dinding-dinding sel. pada bakteri gram negatif, penambahan safranin akan menyebabkan warna bakteri berubah menjadi merah , karena ungu yang dihasilkan oleh kristal violet yodium telah luntur dengan tipisnya membran sel sehingga safrafin dapat terikat. oleh karena itu gram D atau zat kedua berfungsi sebagai membedakan terhadap zat kedua berfungsi sebagi membeda terhadap zat warna kristal violet.
Langkah selanjutnya, 1 tetes kristal violet diteteskan di atas gelas benda tersebut kemudian didiamkan selama 30 detik. Setelah itu, gelas benda dibilas dengan aquades hingga warnanya hilang. Kristal violet merupakan reagen yang berwarna ungu. Kristal violet ini merupakan pewarna primer (utama) yang akan memberi warna pada mikroorganisme target. Kristal violet bersifat basa sehingga mampu berikatan dengan sel mikroorganisme yang bersifat asam. Dengan perlakuan seperti itu, sel mikroorganisme yang transparan akan terlihat berwarna (ungu). Pemberian kristal violet pada bakteri gram positif akan meninggalkan warna ungu muda.   Perbedaan respon terhadap mekanisme pewarnaan gram pada bakteri adalah didasarkan pada struktur dan komposisi dinding sel bakteri. Bakteri gram positif mengandung protein dan gram negatif mengandung lemak dalam persentasi lebih tinggi dan dinding selnya tipis. Kristal violet yang diteteskan didiamkan selama 30 detik bertujuan agar cat atau pewarna ini dapat melekat sempurna pada dinding sel bakteri.
Langkah percobaan yang dilakukan oleh praktikan dimulai dengan 1 tetes sampel yang berupa bakteri sampel A dan bakteri sampel B diteteskan di atas gelas benda yang berbeda. Kedua gelas benda berisi sampel tersebut dipanaskan (fiksasi) di atas bunsen burner. Hal ini bertujuan untuk menguapkan air sehingga hanya akan didapat bakteri saja. Proses fiksasi juga bertujuan supaya bakteri benar-benar melekat pada gelas benda sehingga olesan bakteri berupa tetesan sampel tidak akan terhapus apabila dilakukan pencucian. Yang perlu diperhatikan dalam proses fiksasi adalah bidang yang mengandung bakteri dijaga agar tidak terkena nyala api.
Langkah selanjutnya, 1 tetes iodine diteteskan di atas gelas benda tersebut kemudian didiamkan selama 1 menit. Setelah itu, gelas benda dibilas dengan aquades hingga warnanya hilang. Iodine merupakan pewarna Mordan, yaitu pewarna yang berfungsi memfiksasi pewarna primer yang diserap mikroorganisme target atau mengintensifkan warna utama. Pemberian iodine pada pengecatan Gram dimaksudkan untuk memperkuat pengikatan warna oleh bakteri. Kompleks zat iodin terperangkap antara dinding sel dan membran sitoplasma organisme gram positif, sedangkan penyingkiran zat lipida dari dinding sel organisme gram negatif dengan pencucian alkohol memungkinkan hilang dari sel. Iodine yang diteteskan didiamkan selama 1 menit bertujuan agar pengikatan warna oleh bakteri menjadi semakin lebih kuat.
Selanjutnya, 1 tetes alkohol 96% diteteskan di atas gelas benda tersebut kemudian didiamkan selama 30 detik. Setelah itu, gelas benda dibilas dengan aquades hingga warnanya hilang. Etanol 95% merupakan solven organik yang berfungsi untuk membilas (mencuci) atau melunturkan kelebihan zat warna pada sel bakteri (mikroorganisme). Tercuci tidaknya warna dasar tergantung pada komposisi dinding sel, bila komponen dinding sel kuat mengikat warna, maka warna tidak akan tercuci sedangkan bila komponen dinding sel tidak kuat menelan warna dasar, maka warna akan tercuci. Pemberian alkohol pada pengecatan ini dapat mengakibatkan terjadinya dua kemungkinan yaitu mikroorganisme (bakteri) akan tetap berwarna ungu atau bakteri menjadi tidak berwarna. Pemberian alkohol 96% juga menyebabkan terekstraksi lipid sehingga memperbesar permeabilitas dinding sel.
Reaksi yang terjadi ketika penambahan alkohol 96%gram + : lipid << + alkohol 96%  pori dinding sel yang terbentuk kecil, protein dinding sel terdehidrasi, pori tertutup(kompleks kristal violet-iodine tidak tercuci)gram - : lipid >> + alkohol 96%  pori dinding sel yang terbentuk besar, protein dinding sel terdehidrasi, pori tidak tertutup (kompleks kristal violet-iodine tercuci)
4.2.4 Hasil Pengamatan
Pengamatan yang dilakukan dengan menggunakan mikroskop tampak mikoorganisme dari sampel air kolam dengan pengenceran 10-4 berbentuk dipobasil dengan jenis gram negatif.  Dimana bakteri gram negatif adalah bakteri, yang kehilangan kompleks ungu kristal pada waktu pembilasan dengan alkohol, namun kemdian terwarnai dengan pewara tandingan, yaitu safranin, sehingga sel-sel tampak berwarna merah muda pada akhir pewarnaan.
      Pengamaan kedua yaitu pada sampel usus ikan patin dengan pengenceran 10-4 didapat bakteri monococcus dengan jenis gram positif. Bakteri gram positif adalah bater yang dapat menahan kompleks pewarna primer ungu kristal iodium sampai akhir prosedur dan sel bakteri berwarna biru gelap atau ungu.
                                     






BAB V
PENUTUP
5.1 Kesimpulan
Bakteri dapat dibedakan melalui teknik pewarnaan gram. Pewarnaan  Gram merupakan salah satu teknik pewarnaan yang digunakan untuk mengidentifikasi bakteri (mikroorganisme). Zat warna yang digunakan pada pengecatan Gram meliputi crystal violet, yodium , alkohol dan safraninTeknik pewarnaan tersebut dapat menghasilkan warna merah dan ungu.
Bakteri gram negatif ditandai dengan pewarnaan merah, sedangkan yang positif berwarna ungu. Bakteri yang didapat berdasarkan hasil praktikum, yaitu diplobasil dengan jenis gram negatif dan monococcus dengan jenis gram positif.
5.2 Saran
Diharapkan dalam praktikum selanjutnya alat dan bahan yang dibutuhkan dalam praktikum mikrobiologi, lebih di tingkatkan ketersediaannya.

















DAFTAR PUSTAKA

Awetz, Melnick, Adelberg. 2008. Mikrobiologi Kedokteran Edisi 23. Jakarta: Penerbit Buku Kedokteran EGC.
Dwidjoseputro, D., 1989. Dasar-Dasar Mikrobiologi. Djambatan:Malang
Entjang I, 2003, Mikrobiologi dan Parasitologi Untuk Akademi Keperawatan. Jakarta: PT. Citra Aditya Bakti.
Iud, W. 2008. Teknik dan Metode Dasar Dalam Mikrobiologi. Malang: UMM Pres.
Schlegel, Hans. 1994. Mikrobiologi Umum Edisi Keenam. Yogyakarta: Gajah Mada University Press.




You May Also Like

0 komentar